引言：

免疫组化（IHC）是病理诊断和研究中不可或缺的技术，但在实际操作中常会遇到染色弱、背景深、假阳性等问题。本文汇总了6类常见问题，并提供针对性解决方案，帮助您优化染色结果！

一、无着色或染色弱

可能原因：

1.抗原修复不充分（如修复液pH值错误、时间不足）。

2.一抗浓度过低或孵育时间过短。

3.组织固定过度（如甲醛固定时间＞48小时）。

解决方案：

①优化抗原修复：

-使用pH 6.0柠檬酸盐缓冲液（适用于大多数抗体）。

-高压修复（121℃, 2~3分钟）比微波修复更彻底。

②调整一抗：

-参考抗体说明书，进行浓度梯度测试（如1:50~1:400）。

③控制固定时间：

-推荐 10%中性缓冲福尔马林固定6~24小时。

二、非特异性背景染色

可能原因：

1.内源性过氧化物酶/生物素未完全阻断。

2.一抗非特异性结合（尤其多克隆抗体）。

3.组织干燥或切片过厚。

解决方案：

① 充分阻断：

-使用3% H₂O阻断内源性过氧化物酶（室温10分钟）。

-加正常血清（与二抗同源）减少非特异性结合。

②优化抗体：

-换用单克隆抗体或进行抗体吸附实验。

③ 操作规范：

-保持切片湿润，避免干燥；切片厚度控制在3~4μm。

三、细胞核/浆染色错位

可能原因：

1.抗原修复过度（如高压时间过长）。

2.一抗穿透性差（如大分子抗体）。

解决方案：

① 缩短高压修复时间至1~2分钟。

② 对胞核抗原（如Ki-67），可尝试酶修复（蛋白酶K）。

四、边缘效应（边缘染色深）

可能原因：

1.切片边缘试剂残留（如未充分冲洗）

2.孵育时切片未水平放置。

解决方案：

①每步冲洗后，用滤纸吸干边缘液体。

② 使用湿盒保持湿度，确保孵育环境均匀。

五、阳性对照正常，待检样本无着色

可能原因：

1.待检组织抗原丢失（如固定不当或长期储存）。

2.组织预处理差异（如骨组织需特殊脱钙）。

解决方案：

① 重新取样，确保新鲜组织及时固定。

②对脱钙组织，改用EDTA脱钙液（避免强酸破坏抗原）。

六、DAB显色异常（过深/弥散）

可能原因：

1. DAB显色时间过长或浓度过高。

2.显色后未及时终止反应。

解决方案：

显色时间控制在1~5分钟，显微镜下监控。

显色后立即流水冲洗，或使用终止液。

总结：免疫组化优化流程图

1.确认组织固定合格 → 2.优化抗原修复 → 3.调整一抗浓度/时间 → 4. 严格阻断内源性干扰 → 5. 规范操作（防干燥/边缘效应） → 6. 显色监控

小技巧：遇到问题时，建议先检查阳性对照是否正常，再逐步排查实验步骤！

您在IHC中还遇到过哪些问题？欢迎留言，我们将邀请专家解答！

参考文献

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[4]LIN F, CHEN Z, LIU Y. Nonspecific staining in immunohistochemistry: Causes and solutions[J]. Diagnostic Pathology, 2020, 15(1): 12. DOI: 10.1186/s13000-020-00934-y.

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